Florey se je rodil v Adelaidi v Južni Avstraliji kot sin ravnatelja šole. Obiskoval je St Peter's College v Adelaidi in Univerzo v Adelaidi, kjer je leta 1921 diplomiral z diplomo iz znanosti in leta 1924 z doktoratom medicine.
Po diplomi iz medicine je Florey delal na Inštitutu za medicinske raziskave Walter in Eliza Hall v Melbournu, kjer je spoznal Ernsta Chaina. Leta 1928 sta se preselila na Šolo za patologijo Sir Williama Dunna na Univerzi v Oxfordu, kjer sta se začela ukvarjati z razvojem penicilina.
Penicilin je leta 1928 odkril Alexander Fleming, vendar ni bil razvit v uporabno zdravilo. Floreyju in Chainu je uspelo izolirati učinkovino penicilin in jo prečistiti, da so jo lahko injicirali bolnikom. Razvili so tudi metode za množično proizvodnjo penicilina, kar je omogočilo njegovo široko uporabo med drugo svetovno vojno.
Delo Floreya in Chaina o penicilinu je med drugo svetovno vojno rešilo nešteto življenj in spremenilo zdravljenje nalezljivih bolezni. Florey je leta 1945 prejel Nobelovo nagrado za fiziologijo ali medicino, leta 1944 pa je bil imenovan za viteza.
Florey je bil tudi ugleden upravitelj in vzgojitelj. Od leta 1959 do 1962 je bil prorektor Univerze v Oxfordu, od leta 1960 do 1965 pa je bil predsednik Kraljeve družbe v Londonu. Bil je tudi član Avstralske akademije znanosti, Ameriške akademije znanosti in umetnosti. , in Nacionalna akademija znanosti.
Florey je umrl zaradi možganske kapi v Oxfordu leta 1968. Velja za enega najpomembnejših avstralskih znanstvenikov 20. stoletja, njegovo delo o penicilinu pa je rešilo milijone življenj.